Разработка воспроизводимых и надежных методов оценки антиген-специ-фической активации Т-клеток позволила провести аналогичные исследования in vitro. Как и раньше, поглощение белковых антигенов макрофагами определяли с помощью радиоактивных изотопов, а иммуногенность оценивали по способности инкубированных с антигеном макрофагов активировать пролифе-рацию иммунных Т-клеток in vitro. Хотя результаты исследований in vivo и in vitro в целом были сходны, обнаружился также и ряд отличий, частично изменивших наши представления о процессинге антигена в макрофагах.

Макрофаги, инкубированные с растворимыми белковыми антигенами in vitro, накапливали иммунологически активный антиген по двухступенчатому механизму [48]. Первый этап включал связывание молекул антигена с поверх-ностью макрофагов; этот этап не зависел от температуры. Потенциальная имму-ногенность молекул антигена, связавшихся с поверхностью макрофагов во вре-мя инкубации при 4° С, полностью подавлялась трипсинизацией макрофагов сразу после инкубации (рис. 5.2). Этот результат показывает, что после инку-бации при 4 °С молекулы антигена экспонированы на поверхности макрофагов. Второй этап захвата антигена макрофагами зависел от температуры и включал поглощение макрофагами молекул антигена, связанных с их поверхностью [49]. Подавление окислительного и гликолитического метаболизма с помощью азида
и 2-дезоксиглюкозы угнетало накопление иммуногенной активности макро-фагами, инкубированными при 37° С (табл. 5.9). Цитохалазин В, агент, бло-кирующий макро(но не микро-)пиноцитоз, не влиял на поглощение антигена [50]. Таким образом, выраженная способность макрофагов приобретать имму-ногенный потенциал при 37° С связана с механизмом поглощения антигенатребующим затрат метаболической энергии. Поглощение антигена макрофагами, инкубированными с антигеном при 4° С, не зависело от активных метаболических процессов и, по-видимому, заключалось в связывании антигена с поверхностью клетки.Параллельно с экспериментами, в которых определялась функциональная активность макрофагов, проводились биохимические исследования. Они пока-зали, что используемый в большинстве работ такого рода антиген, 1251-динитро-фенилальбумин морской свинки (ДНФ-АМС), быстро разрушался в макрофагах, но, как и в случае с гемоцианином, 20% антигена оставались связанными с клетками в течение трех дней культивирования [51]. Небольшое количество белка секретировалось в культуральную среду, а часть связанного с клетками белка находилась на клеточной поверхности и могла быть удалена обработкой трипсином. В то же время между этими работами и теми, которые были описаны выше, выявились существенные различия, касающиеся функциональных эффектов обработки инкубированных с антигеном макрофагов трипсином и антителами к ДНФ-АМС. Хотя обработка макрофагов, инкубированных с ДНФ-АМС, трипсином и удаляла поверхностные молекулы настолько, что антитела к ДНФ-АМС переставали связываться с клетками, иммуногенность макрофагов при этом сохранялась даже через 24 и 48 ч после инкубации с антигеном. Трипси-низация влияла на иммуногенность лишь в том случае, если ее проводили сразу после инкубации с антигеном при 4° С, т. е. в тот момент, когда большая часть молекул антигена оставалась на клеточной поверхности. Из этих результатов был сделан вывод, что для зависимого от макрофагов распознавания антигена Т-клетками основное значение имеет трипсин-резистентный компонент ассоциированного с макрофагами антигена, вероятно находящийся внутри клеток. Поскольку антитела к антигену также не влияли на способность инкубированных с ним макрофагов активировать примированные Т-клетки, сделали вывод, что антиген должен находиться в месте, не доступном также и для антител (табл. 5.10).В интерпретации этих результатов имеется одна трудность: макрофаги разрушают большую часть эндоцитированного антигена, используя обычный лизосомный механизм. В любой работе, где делается попытка определить зави-симость иммуногенной активности от количества поглощенного макрофагами антигена, необходимо учитывать процесс постепенной деградации антигена наряду с возможно важным в иммунологическом отношении процессингом антигена. Недоступность для трипсина существенных для активации Т-клеток моле-

кул антигена хотя и свидетельствует в пользу того, что антиген поглощается клетками, но все же не доказывает этого строго. Конечно, поглощение молекул антигена путем пиноцитоза — наиболее вероятная гипотеза, но возможно, что связанные с мембраной молекулы антигена в ходе какого-то энергозависимого процесса скапливаются в складках клеточной поверхности и становятся нечувствительными к трипсинизации. Возможно также, что антиген на самом деле находится на клеточной поверхности и чувствителен к трипсину, однако его удаление с поверхности макрофагов при трипсинизации сопровождается постепенным выходом новых молекул антигена из цитоплазмы на поверхность, происходящим за то длительное время инкубации, которое необходимо для оценки активации Т-клеток. Хотя результаты многих работ показывали, что эта возможность маловероятна, в последнее время появились данные, подтвер-ждающие ее.

Другой подход к биохимическому анализу процессинга антигена заклю-чается в сравнении двух сходных клеточных популяций, одна из которых спо-собна презентировать антиген, а другая лишена этой способности. Как ука-зывалось ранее, клетки некоторых В-лимфом могут презентировать антиген, в то время как нормальные В-лимфоциты относительно неэффективны в качестве антиген-презентирующих клеток [52]. Однако когда нормальные В-клетки акти-вировали поликлональным В-клеточным митогеном, липополисахаридом, то образующиеся через три дня после стимуляции В-лимфобласты презентировали антиген так же эффективно, как и В-лимфомы (табл. 5.11). Этот результат пока-
зывает, что способность В-клеток функционировать в качестве антиген-пре-зентирующих клеток определяется стадией их дифференцировки и что трех-дневные индуцированные ЛПС лимфобласты и В-клеточные лимфомы находятся как раз на соответствующей стадии созревания.
Сравнение нормальных В-лимфоцитов с В-лимфобластами и В-лимфомами показало, что, хотя В-клетки могут сорбировать антиген на своей поверхности

и осуществлять жидкофазный пиноцитоз, активность этих процессов у них гораздо ниже, чем у В-лимфобластов и клеток В-лимфом [15]. Так, способность связывать KLH у них была в 10 раз ниже, чем у В-лимфом. Опишем подробно один из экспериментов, показавших, что неспособность В-лимфоцитов пред-ставлять антиген вызвана недостаточным его связыванием [15]. В этом экспе-рименте определяли, могут ли покоящиеся В-лимфоциты представлять кроличьи антитела к мышиным Ig Т-клеткам мыши, примированным нормальным кро-личьим гамма-глобулином. Предполагалось, что кроличьи антитела к мышиным Ig, связываясь с поверхностными Ig, должны эффективно захватываться нормальными В-клетками. Действительно, нормальные В-лимфоциты эффективно презентировали антиген при обработке их кроличьим антимышиным Ig, но совершенно не презентировали нормальные гамма-глобулины кролика. Хотя этот результат хорошо согласуется с предположением о недостаточно эффективном поглощении антигена нормальными В-лимфоцитами, возможно и другое объяснение. Оно заключается в том, что кроличьи антитела к мышиным Ig активировали покоившиеся В-клетки, в результате чего они дифференцировались и достигали той стадии созревания, при которой начинается выделение лимфокина, например ИЛ-1, необходимого для активации Т-клеток, или же появляется возможность выполнять такие функции, которые не могут осуществляться покоящимися В-клетками. Так, В-лимфомы и В-лимфобласты могут осуществлять некие важные этапы процессинга антигена, на что покоящиеся В-клетки не способны. Другая возможность состоит в том, что на мембране активированных В-клеток имеются некие структуры, необходимые для эффективного взаимодействия В- и Т-клеток, которые отсутствуют у покоящихся В-клеток.